Die Anfänge der Sammlung gehen auf die Gründungszeit des Museums zurück, und ihr Entstehen ist der Initiative und Sammeltätigkeit Hermann Roemers (1816-1894) zu verdanken. Mit dem Umbau der Martinikirche 1855 zum Stadtgeschichtlichen Museum  verfolgten die Gründerväter eine universalgeschichtliche Zielsetzung, die „die Verbreitung und die Kenntnis der Natur und der Kunst“ fördern sollte.
Ende des 19. Jahrhunderts umfasste die Kunstsammlung neben der Gemäldesammlung mit Leihgaben der Berliner Museen und der Kupferstichsammlung auch eine beträchtliche Kollektion an Gipsabdrücken antiker Skulpturen, die heute weitestgehend als Kriegsverlust zu beklagen sind, sowie eine umfangreiche Münzsammlung. 
1945 war bedingt durch die Kriegszerstörungen ein einschneidendes Jahr. Mit dem Neubau des Museums mussten auch die alten Präsentationskonzepte modernen Ausstellungsformen weichen, und andere Sammlungsschwerpunkte traten in den Vordergrund. Der Kunstbestand wird seitdem nur noch bei Sonderausstellungen gezeigt.  

Die Gemälde- und Skulpturensammlung umfasst rund 1000 Werke. Von sakraler Kunst seit dem späten Mittelalter, die aus den umliegenden Kirchen und Kapellen in das Museum gelangten, über Porträts bis hin zu topografischen Ansichten und Werken Hildesheimer Künstler.

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Die Grafische Sammlung des Roemer- und Pelizaeus-Museums umfasst etwa 10.000 Blatt Druckgrafik vom 16. Jahrhundert bis zur Gegenwart und einen kleinen Bestand an Handzeichnungen. Von der Gründung des Museums bis zum Anfang des 20. Jahrhunderts galt neben Bildnissen und Darstellungen zur Topographie Hildesheims die Hauptaufmerksamkeit dem Erwerb von Reproduktionsgrafik.  Die Sammlung gewährt einen Einblick in Geschichte und Technik von den Stechern der Rubens-Schule bis zu den letzten aufwendigen Reproduktionsstichen des 19. Jahrhunderts.

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